Alt-R™ CRISPR-Cas9 rendszer: újdonság az Integrated DNA Technologies®-től!

A rendszer tehát a genom igen pontos és hatékony szerkesztésére alkalmas, a Cas9 endonukleáz enzimet használja fel a DNS kettős szálú törés létrehozásához. A Cas9 endonukleáz egy CRISPR RNS (crRNS) segítségével azonosítja be a target DNS szekvenciát. A CRISPR crRNS mellett egy transzaktiváló CRISPR RNS (tracrRNS is) szükséges az endonukleáz aktiválásához, és a működőképes ribonukleoprotein komplex létrejöttéhez. A natív Streptococcus pyogenes rendszer crRNS-e 42, tracRNS-e 89 bázispár hosszú, ezek együttesen szükségesek tehát a Cas9 endonukleáz megfelelő targethez irányításához és a kettős szálú DNS specifikus hasításához. A hasított DNS javítása ezután a nem homológ végek egyesítésével (non-homologous end joining - NHEJ), vagy homológia alapú rekombinációval (homology directed repair – HDR) történik, ami az eredeti szekvencia módosulását eredményezheti. 

Az IDT optimalizált Alt-R CRISPR továbbfejlesztett rendszere egy rövidített, 67 bázispáros tracrRNS oligonukleotidot, és egy szintén rövidített 36 bázispáros crRNS-t használ a kettősszálú DNS target Cas9 enzim általi minél pontosabb szerkesztéséhez. A kémiailag módosított crRNS tartalmaz egy 19-20 bázis hosszúságú specifikus protospacer régiót és egy 16 bázispáros, a tracrRNS-sel fúzionáló domént. A DNS-RNS komplex létrejöttéhez alapvető fontosságú még egy úgynevezett PAM (protospacer adjacent motif) szekvencia megléte is mind a target DNS-en, mind a crRNS-en.

Az IDT ALT-R CRISPR rendszer jellemzői és előnyei

Az ALT-R CRISPR rendszerre más CRISPR rendszerekhez, például a natív S. pyogenes crRNS - tracrRNS komplexhez viszonyítva jóval nagyobb target specificitás jellemző.

Az ALT-R CRISPR rendszer része az E. coli törzsben termelt, tisztított, kodon optimalizált rekombináns S. pyogenes Cas9 endonukleáz. Az enzim 1 N-terminális nukleáris lokalizációs szekvenciát (NLS), 2 C-terminális NLS-t, és C-terminális 6-His címkét tartalmaz. A 3NLS-t tartalmazó Cas9 endonukleáz az Alt-R CRISPR crRNS-sel és a tracrRNS-sel olyan ribonukleoproteint (RNP) komplexet hoz létre, ami a legtöbb target esetén nagyon magas szerkesztési hatékonyságot eredményez. Az RNP komplex használatával megoldhatóak olyan problémás esetek is, amelyek mRNS vagy DNS expressziós konstruktok használatával felmerülhetnek. Például, az Alt-R S. pyogenes Cas9 endonukleázának használatával a sejtekbe juttatott Cas9 mennyisége precízen szabályozható, és ez a nem megújuló Cas9 mennyiség így limitálni tudja az enzim működésének időtartamát is. Ezek a tényezők összességében csökkentik az off-target hatást. Ráadásul az RNP használata kiküszöböli a DNS konstruktok esetén alkalmanként előforduló genomi beépülést, és a transzfektált mRNS toxikusságának lehetőségét is

A ribonukleoprotein sejtekbe való bejuttatása igen hatékonnyá tehető lipofekcióval vagy elektroporációval. Ez a módszer az in vitro átíródó Cas9 rendszerrel szemben nem toxikus és nem aktiválja a veleszületett immunválaszt sem

Bár számos algoritmus létezik, amelyekkel a crRNS 19–20 bázis hosszúságú protospacer szekvenciája megterveztethető, ezek közül néhány erős genomszerkesztési aktivitást eredményez. Az ALT-R CRISPR rendszerrel végzett kísérletek adatai azt mutatják, hogy a szekvencia tervezésének hiánya ellenére az optimalizált RNS-ekkel végzett genomszerkesztés a DNS targetek többségében erősen specifikus lesz.

Az ALT-R CRISPR rendszerben a Cas9 endonukleáz elsősorban az RNP részeként jut be a sejtbe, a rendszer azonban kompatibilis más forrásokból származó Cas9 enzimekkel is, például az S. pyogenes Cas9 endunukleázt stabilan expresszáló sejtek vagy DNS/mRNS konstruktok révén. A külön rendelhető Cas9 expressziós plasmid konstitutív Cas9 expressziót biztosít CMV promoter irányításával

Az ALT-R CRISPR rendszer crRNS-ének kémiai módosítása megvédi a crRNS-t a celluláris RNázok általi lebontástól, a tracrRNS kémiai módosítása pedig megnövekedett nukleáz rezisztenciát kölcsönöz a molekulának, valamint tovább javítja a target specificitást. A kémiai módosításokat a megrendelt Alt-R CRISPR crRNS oligonukleotid szekvencia automatikusan tartalmazni fogja.

A kontroll kit tartalmaz egy, a HPRT(hipoxantin foszforibozil-transzferáz) génre specifikus Alt-R CRISPR HPRT pozitív kontrol crRNS-t, és egy validált Alt-R CRISPR negatív kontrollt is. Ezen kívül a kithez tartozik a kontrol crRNS-ekkel komplementer Alt-R CRISPR tracrRNS is, valamint nukleáz mentes duplex puffer, és olyan validált PCR primerek, amik a kiválasztott organizmus megfelelő HPRTrégióira specifikusak. A kitbe tartozó PCR assay teszi ideálissá a rendszert a HPRT gén módosításának ellenőrzéshez.